<div dir="ltr">Stephanie,<div><br></div><div>You are correct. The tube lens (the 25mm) of the 2nd telescope needs to be focused at the back focal plane (BFP) of the illumination objective. Move the focus from the BFP and the light sheet exiting the objective will either converge or diverge i.e. the sheet won't be collimated in the XY plane and it'll look fan shaped. Conversely, even if you do move the objective/chamber along the axis of the objective, the XZ plane will remain in focus at 3.5 mm from the nose of the objective as the laser is collimated in that plane at the BFP. Of course this behavior assumes all of the upstream optics are in proper relationship to each other. You could have the upstream alignments wrong and still get a visibly collimated sheet with the 25 mm tube lens not focused in the BFP but your light sheet quality will be somewhere between slightly off to just plain crap as well as potentially being tilted out of and/or within the detection plane. The final four optical elements are indeed functionally tied together. The cylindrical lens shares a focal plane with the following 50mm which shares a focal plane with the 25mm which shares a focal plane with the objective all of which only work if the laser coming into the cylindrical is collimated and enters into the center and is on axis.</div><div><br></div><div>Your next question might well be: where is the BFP of an objective? As most objective houses won't tell you, you have to find it experimentally. This can be done pretty easily. Assuming your system is assembled, mirror align the laser, all lenses removed from their mounts, to the center and along the axis of the illumination objective. Fill the sample chamber with water containing a fluorophore appropriate to your laser. With the laser and camera on and the objectives correctly placed with respect to each other, you should see the laser focal point more or less in the center of the camera image. Please note that your alignment could be pure genius and still look stuffed up if your camera and tube lens aren't aligned with and centered on the detection objective axis. Move the illumination objective to center the laser focal point in the FOV and move the detection objective to bring the beam into best focus. Try using profile plot with live update in Fiji while dragging the ROI around to find the highest intensity point i.e the center. If the beam is tilted within or out the FOV plane, the laser is entering the objective at an angle to the axis (or the objectives aren't square to each other). Too high or too low, and the beam is parallel to the objective axis but not _on_ the axis. The laser back reflection off a properly aligned objective should line up with the laser spot on the mirror face. It's also fair to note that the sample chamber may be poorly mounted and the objective ports not be perfectly in plane and at 90 degrees to each other. This is important to consider because if you start with a well aligned beam i.e. in plane, 50 mm from the optics board and centered through the lens mounts, and then tilt the beam to match a poorly placed or built chamber, which is certainly an optical element in this build, you'll never get a really good alignment after putting the optics back in the system as they are all mounted on fixed height posts and now might not co-axially align with the new beam path.</div><div><br></div><div>Once you're satisfied with the location of the beam and chamber, place a point reference either on the monitor (a Post-It corner works) or an ROI on the live imaging window to mark the center point of focus for later use. Place the 25 mm lens in question on the rail. Turn the laser back on and live image while you slide the lens back and forth; you are in the BFP when the light sheet exiting the objective is collimated. It really helps if you have a thin object in the beam path as the shadows cast are very good indicators of collimation and the expanded beam will be much fainter (and possibly impossible to resolve clearly) than the focused beam. Look for zero convergence/divergence of the shadows. Measure the distance from the lens mount to the objective for your future reference. Note: if your lens mount is rotated about the pillar mount axis or tipped at some small angle, you won't be able to discern the issue until you mount the 50 mm lens. Which then leaves you with a two variable question but...</div><div><br></div><div>When you place the 50 mm telescope lens onto the rail you can co-localize its focal point with the 25 mm lens focal point by sliding it along until the laser is in focus and located at your previously marked center point. The center will be harder to find as the NA of the beam will be smaller than the raw laser and thus the Rayleigh length longer. Again Fiji profile can help. If the beam is tilted in the plane and/or out of plane, the laser and the lens or lens pair don't share an axis. Adjust the lens, actually more likely both lenses, as best as you can and move the beam via the mirrors only as a last resort. This is the fiddly frustrating bit of putting together a base level OpenSPIM as finding the right set of sub-optimal alignments of mostly fixed optics that will work in the end is a deeply iterative process.You can continue the alignment from this point by working backwards through the remaining optics though I would leave the cylindrical for last and you'll need to place the beam expander lens pair as a group. Using a 1" 50mm achromat lens in place of the cylindrical for initial alignment can be useful to get mounting angles close because cylindrical lenses can be very difficult to center properly.</div><div><br></div><div>Finish up your alignment with a fine tune of light sheet planar and focal parameters via imaging the center of an agarose cylinder sample containing fluoro beads or simply dumping enough beads into chamber water (without fluorophore of course). It'll be very obvious if your sheet is tipped out of the detection focal plane. This is really the only way to get cylindrical rotation correct. While you're at it, fine focus the detection objective. A large number of out of focus beads in front of and/or behind the focal plane indicates a loss of optical confinement and can mean your sheet is badly formed. Take the opportunity to adjust the corner mirror to understand what changes are reflected in light sheet propagation. You can also use the airy discs of out of focus beads to tell you if your detection objective, tube lens and camera are well aligned. I don't recommend using an agarose cylinder for the initial build process as the agarose cylinder will steer the beam potentially leaving your baseline alignment crooked. Of course you're correct if you think the same issue is at work during sample imaging. Nature of the beast.</div><div><br></div><div>Well it isn't a short answer but hopefully it's a useful one. Have a good weekend.</div><div><br></div><div>Cheers,</div><div><br></div><div class="gmail_extra"><div><div class="gmail_signature"><div dir="ltr"><div><div dir="ltr"><div><span style="font-size:12.8px">- David</span><br></div><div><br></div><div><font size="1">David Potter</font></div><div><font size="1">Lattice Light Sheet Microscopy Manager</font></div><div><font size="1">Monash Micro Imaging - Advanced Optical Microscopy</font></div><div><font size="1">Monash University Clayton, VIC 3800, Australia</font></div><div><br></div><div><br></div></div></div></div></div></div>
<br><div class="gmail_quote">On 10 June 2017 at 03:00,  <span dir="ltr"><<a href="mailto:openspim-request@openspim.org" target="_blank">openspim-request@openspim.org</a>></span> wrote:<br><blockquote class="gmail_quote" style="margin:0px 0px 0px 0.8ex;border-left:1px solid rgb(204,204,204);padding-left:1ex">Send OpenSPIM mailing list submissions to<br>
        <a href="mailto:openspim@openspim.org">openspim@openspim.org</a><br>
<br>
To subscribe or unsubscribe via the World Wide Web, visit<br>
        <a href="http://openspim.org/mailman/listinfo/openspim" rel="noreferrer" target="_blank">http://openspim.org/mailman/<wbr>listinfo/openspim</a><br>
or, via email, send a message with subject or body 'help' to<br>
        <a href="mailto:openspim-request@openspim.org">openspim-request@openspim.org</a><br>
<br>
You can reach the person managing the list at<br>
        <a href="mailto:openspim-owner@openspim.org">openspim-owner@openspim.org</a><br>
<br>
When replying, please edit your Subject line so it is more specific<br>
than "Re: Contents of OpenSPIM digest..."<br>
<br>
<br>
Today's Topics:<br>
<br>
   1. distance telescope illumination objective (Dr S. Hoehn)<br>
   2. Re: distance telescope illumination objective (Weber, Michael)<br>
<br>
<br>
------------------------------<wbr>------------------------------<wbr>----------<br>
<br>
Message: 1<br>
Date: Fri, 09 Jun 2017 14:42:58 +0100<br>
From: "Dr S. Hoehn" <<a href="mailto:S.Hoehn@damtp.cam.ac.uk">S.Hoehn@damtp.cam.ac.uk</a>><br>
To: <a href="mailto:OpenSPIM@openspim.org">OpenSPIM@openspim.org</a><br>
Subject: [OpenSPIM] distance telescope illumination objective<br>
Message-ID: <<a href="mailto:a76138ed3fecf6377274c4ef4de4b2db@cam.ac.uk">a76138ed3fecf6377274c4ef4de4b<wbr>2db@cam.ac.uk</a>><br>
Content-Type: text/plain; charset=US-ASCII; format=flowed<br>
<br>
Dear all,<br>
<br>
do I understand correctly that there has to be a specific distance<br>
between the last telescope lens and the illumination objective?<br>
<br>
So I could NOT move the sample chamber further away from the telescope?<br>
I was thinking about doing this since we have a wider bread board and a<br>
longer path would make it easier to align the laser.<br>
<br>
Thank you,<br>
<br>
Stephanie<br>
<br>
<br>
Dr. Stephanie Hoehn<br>
DAMTP, Biological Physics<br>
Centre for Mathematical Sciences<br>
Wilberforce Road<br>
Cambridge<br>
CB3 0WA<br>
United Kingdom<br>
Office Tel: 01223 337859<br>
Office: H0.03<br>
<br>
<br>
<br>
<br>
<br>
------------------------------<br>
<br>
Message: 2<br>
Date: Fri, 9 Jun 2017 14:15:14 +0000<br>
From: "Weber, Michael" <<a href="mailto:Michael_Weber@hms.harvard.edu">Michael_Weber@hms.harvard.edu</a><wbr>><br>
To: "<a href="mailto:OpenSPIM@openspim.org">OpenSPIM@openspim.org</a>" <<a href="mailto:OpenSPIM@openspim.org">OpenSPIM@openspim.org</a>><br>
Subject: Re: [OpenSPIM] distance telescope illumination objective<br>
Message-ID:<br>
        <<a href="mailto:BLUPR0701MB17450275AAC2BBB12FDF1062DDCE0@BLUPR0701MB1745.namprd07.prod.outlook.com">BLUPR0701MB17450275AAC2BBB12F<wbr>DF1062DDCE0@BLUPR0701MB1745.<wbr>namprd07.prod.outlook.com</a>><br>
<br>
Content-Type: text/plain; charset="utf-8"<br>
<br>
Hi Stephanie,<br>
<br>
<br>
<br>
Every distance after the cylindrical lens is critical. Moving the sample chamber with respect to the telescope will shift the position of the light sheet waist. If you want to increase the distance between telescope and chamber you could build the telescope out of two lenses with longer focal lengths but the same ratio.<br>
<br>
<br>
<br>
Best,<br>
<br>
Michael<br>
<br>
<br>
<br>
From: Dr S. Hoehn<mailto:<a href="mailto:S.Hoehn@damtp.cam.ac.uk">S.Hoehn@damtp.<wbr>cam.ac.uk</a>><br>
Sent: Friday, June 9, 2017 9:43 AM<br>
To: <a href="mailto:OpenSPIM@openspim.org">OpenSPIM@openspim.org</a><mailto:<a href="mailto:OpenSPIM@openspim.org">O<wbr>penSPIM@openspim.org</a>><br>
Subject: [OpenSPIM] distance telescope illumination objective<br>
<br>
<br>
<br>
Dear all,<br>
<br>
do I understand correctly that there has to be a specific distance<br>
between the last telescope lens and the illumination objective?<br>
<br>
So I could NOT move the sample chamber further away from the telescope?<br>
I was thinking about doing this since we have a wider bread board and a<br>
longer path would make it easier to align the laser.<br>
<br>
Thank you,<br>
<br>
Stephanie<br>
<br>
<br>
Dr. Stephanie Hoehn<br>
DAMTP, Biological Physics<br>
Centre for Mathematical Sciences<br>
Wilberforce Road<br>
Cambridge<br>
CB3 0WA<br>
United Kingdom<br>
Office Tel: 01223 337859<br>
Office: H0.03<br>
<br>
<br>
<br>
______________________________<wbr>_________________<br>
OpenSPIM mailing list<br>
<a href="mailto:OpenSPIM@openspim.org">OpenSPIM@openspim.org</a><br>
<a href="http://openspim.org/mailman/listinfo/openspim" rel="noreferrer" target="_blank">http://openspim.org/mailman/<wbr>listinfo/openspim</a><br>
-------------- next part --------------<br>
An HTML attachment was scrubbed...<br>
URL: <<a href="http://openspim.org/pipermail/openspim/attachments/20170609/e5eae151/attachment-0001.html" rel="noreferrer" target="_blank">http://openspim.org/<wbr>pipermail/openspim/<wbr>attachments/20170609/e5eae151/<wbr>attachment-0001.html</a>><br>
<br>
------------------------------<br>
<br>
Subject: Digest Footer<br>
<br>
______________________________<wbr>_________________<br>
OpenSPIM mailing list<br>
<a href="mailto:OpenSPIM@openspim.org">OpenSPIM@openspim.org</a><br>
<a href="http://openspim.org/mailman/listinfo/openspim" rel="noreferrer" target="_blank">http://openspim.org/mailman/<wbr>listinfo/openspim</a><br>
<br>
<br>
------------------------------<br>
<br>
End of OpenSPIM Digest, Vol 46, Issue 2<br>
******************************<wbr>*********<br>
</blockquote></div><br></div></div>