
<html><head><meta http-equiv="Content-Type" content="text/html charset=iso-8859-1"></head><body style="word-wrap: break-word; -webkit-nbsp-mode: space; -webkit-line-break: after-white-space; ">I will expand the section <div><br></div><div><a href="http://openspim.org/Drosophila_embryo_sample_preparation#What_beads_to_use.3F">http://openspim.org/Drosophila_embryo_sample_preparation#What_beads_to_use.3F</a></div><div><br></div><div>on the bead selection. It is a complex problem with three variables, the strength of your signal, the laser power and the properties of your emission filter (band-pass versus long-pass). I recommend to get several wavelengths of beads and experiment with your particular conditions. I can provide some guidelines for His-YFP.</div><div><br></div><div>That the lines come from beads came as a surprise to me. This is most likely caused by the fact that they are too large, i.e. not sub resolution. Bright beads can be a little disturbing but I have never seen anything like that.</div><div><br></div><div>All the best</div><div><br></div><div>PAvel</div><div><br></div><div><div><div>On Jun 14, 2013, at 6:22 PM, Johannes Schindelin <<a href="mailto:Johannes.Schindelin@gmx.de">Johannes.Schindelin@gmx.de</a>> wrote:</div><br class="Apple-interchange-newline"><blockquote type="cite">Hi Luke,<br><br>On Fri, 14 Jun 2013, Luke Stuyvenberg wrote:<br><br><blockquote type="cite">On 06/14/13, Johannes Schindelin wrote:<br><br><blockquote type="cite">Also, as I told Julie on her way out: we absolutely have to use<br>off-frequency beads. Our signal is too delicate to be overlaid by<br>beads having a field day.<br></blockquote><br>I agree. Before we finished imaging, Julie decided to work with the red<br>beads on Monday; next Thursday we should be able to put together some<br>samples with weaker beads.<br><br><blockquote type="cite">This might need some changes on the Wiki to make it *very clear* that<br>you should *never* use beads that are excited by exactly the<br>wavelength of the laser.<br></blockquote><br>I should point out that these are 20um beads causing the flares. It's<br>possible that sub-resolution beads (even those specifically excited by<br>our laser) won't have the same dramatic effect as these. In other words<br>'*never*' might be a bit overzealous; I'm sure there are times when<br>operators would like a very strong bead signal.<br></blockquote><br>Given that Dresden had substantial problems even with sub-resolution<br>beads, I would actually wager a bet that "never" is the correct adjective<br>here: I highly doubt that any non-toxic amounts of fluorophores translated<br>from reporter genes would come even close to the amount of fluorophores<br>present even in the tiniest sub-resolution beads made by humans.<br><br>In any case, the idea of OpenSPIM is to make things easier by sharing<br>knowledge, right? So even if I'd lose my bet, it would be the appropriate<br>thing to share the insight that non-off-color beads *were* too bright in<br>our case.<br><br>Ciao,<br>Johannes</blockquote></div><br></div></body></html>